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RNA-seq到底是什么？

　　核心定义:RNA-seq的全称是转录组测序，是指通过高通量测序技术对组织、细胞样本中的所有RNA分子进行测序，进而定量分析基因表达水平、识别转录本结构变异、挖掘未知转录本的一类技术。和全基因组测序不同，RNA-seq检测的是当前样本中正在发生表达的基因序列，能够直接反映基因的活性状态。

　　技术分类:目前常见的RNA-seq可以根据检测对象分为mRNA测序、小RNA测序、全转录组测序、单细胞RNA测序等不同类型，不同类型的检测成本、适用场景存在明显差异，用户可以根据自身的研究或者诊疗需求选择对应的检测类型。

RNA-seq的核心工作原理是什么？

　　核酸捕获与扩增:RNA-seq的核心逻辑是基于中心法则，首先从样本中提取出所有的RNA分子，之后根据检测需求筛选出目标类型的RNA（比如mRNA会通过polyA尾富集），之后将RNA反转录为更稳定的cDNA分子，再通过PCR扩增获得足够的测序文库。

　　高通量测序与序列比对:建好的文库会通过Illumina、华大智造等品牌的高通量测序仪进行测序，获得大量的短读长序列片段，之后通过生物信息学分析工具，将这些短序列比对到参考基因组上，确定每个序列对应的基因位置。

　　定量与注释分析:完成比对后，会统计每个基因对应的序列数量，以此计算基因的表达量，之后再根据研究需求完成差异表达分析、富集分析、可变剪切分析等个性化分析，最终输出可视化的分析报告。

完整的RNA-seq实验与分析流程包含哪些步骤？

　　样本制备与质控:首先需要采集符合要求的样本，常见的样本类型包括组织、细胞、血液、体液等，样本采集后需要按照标准流程存储避免RNA降解，送到实验室后首先会对RNA的完整性、纯度进行检测，只有质控合格的样本才会进入后续实验环节，质控不合格的样本需要重新采集。

　　文库构建与测序:质控合格的RNA会经过片段化、反转录、末端修复、加接头、PCR扩增等步骤完成文库构建，构建好的文库需要再次进行质控，确认文库的浓度、片段大小符合测序要求，之后按照检测所需的测序数据量要求上测序仪完成测序。

　　生物信息学分析:下机的原始测序数据首先会进行质量过滤，去除低质量的序列、接头序列等污染，之后完成序列比对、表达定量，再根据用户需求完成基础分析和个性化分析，最终交付原始测序数据、分析报告等结果。

临床和科研场景下RNA-seq的收费区间是多少？

　　科研场景收费标准:科研场景下的常规 bulk RNA-seq（混合细胞转录组测序）收费一般在每个样本1500元到3000元不等，收费差异主要来自测序数据量、分析内容的多少，单细胞RNA-seq的收费更高，每个样本的收费区间在2万元到8万元不等，具体价格和细胞捕获数量、测序数据量直接相关。

　　临床场景收费标准:目前已经获批应用于临床的RNA-seq检测项目主要集中在肿瘤分子分型、遗传病辅助诊断领域，比如北京协和医院、四川大学华西医院等三甲医院开展的肿瘤融合基因检测（基于RNA-seq技术）收费一般在3000元到6000元不等，具体价格会根据检测的基因数量、分析内容有所浮动。

RNA-seq相比传统转录组检测技术有哪些优势？

　　检测范围更广:传统的基因芯片技术只能检测已知的转录本，无法发现未知的转录本、可变剪切事件，而RNA-seq可以对样本中的所有转录本进行无差别检测，不仅能够定量已知基因的表达量，还能挖掘新的转录本、稀有转录本、融合基因等变异信息，更适合探索性的研究和复杂疾病的分子机制解析。

　　灵敏度和准确性更高:RNA-seq的动态检测范围更广，对于低表达的基因也能实现准确定量，检测的重复性更好，同时不需要提前设计探针，避免了探针杂交带来的背景噪音问题，对于基因表达差异的检测准确率比传统芯片技术提升30%以上，已经逐步取代芯片成为转录组研究的主流技术。

RNA-seq的主要应用领域覆盖哪些场景？

　　基础科研领域:在生命科学基础研究领域，RNA-seq被广泛应用于发育生物学、分子生物学、植物学等方向的研究，比如中国科学院遗传与发育生物学研究所的多个研究团队都采用RNA-seq技术解析动植物的发育调控机制、逆境响应机制，相关研究成果多次发表在《细胞》《自然》等顶刊上。

　　临床诊疗领域:在临床领域，RNA-seq已经被应用于肿瘤的分子分型、预后评估、用药指导，以及罕见病的辅助诊断、病原微生物检测等场景，比如复旦大学附属肿瘤医院已经将RNA-seq技术常规应用于肉瘤、肺癌等恶性肿瘤的分子分型，为患者的个性化治疗方案制定提供依据。

　　工业研发领域:在生物医药工业领域，RNA-seq被用于药物靶点筛选、药物疗效评估、疫苗研发等环节，比如恒瑞医药、百济神州等国内创新药企都搭建了基于RNA-seq的药物筛选平台，大幅提升了靶点发现的效率，缩短了新药研发的周期。

RNA-seq检测常见的FAQ有哪些？

　　RNA-seq检测对样本有什么要求？:不同类型的样本要求不同，一般组织样本需要重量大于50mg，细胞样本数量大于10^6个，血液样本需要用特殊的RNA保护管采集，避免RNA降解，样本采集后需要尽快放入-80℃冰箱存储，避免反复冻融。

　　RNA-seq测序数据量一般选多少合适？:常规的bulk mRNA测序一般选6G到10G的测序数据量就可以满足绝大多数研究需求，如果是要检测可变剪切、低表达基因可以选择10G到15G的数据量，单细胞RNA-seq一般每个细胞测50k到100k读长就可以满足基础分析需求。

　　RNA-seq可以代替全基因组测序吗？:不可以，RNA-seq检测的是当前样本中正在表达的基因，无法检测非编码区的变异、不表达的基因的变异，两种技术的适用场景不同，需要根据研究或诊疗需求选择，部分复杂疾病的研究需要同时做两种测序进行联合分析。

　　正常人体可以做RNA-seq检测吗？:可以，但是如果没有相关的诊疗或科研需求，不建议普通健康人群盲目做RNA-seq检测，目前RNA-seq在健康人群中的常规体检应用还没有明确的临床指南指导，检测结果的解读缺乏统一标准。

　　RNA-seq检测结果多久可以拿到？:科研场景下的RNA-seq检测从样本到交付报告一般需要2周到4周不等，临床应用的RNA-seq检测项目出结果的时间一般在7天到14天不等，具体时间会根据检测的类型、分析内容的多少有所浮动。

　　RNA-seq检测发现的基因表达异常就代表患病吗？:不一定，基因表达会受到环境、生活习惯、生理周期等多种因素的影响，一过性的表达异常并不代表患有疾病，需要结合临床症状、其他检查结果综合判断，检测结果需要由专业的临床医生或者科研人员解读。

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